2024年10月17日，國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和臨床應(yīng)用領(lǐng)導(dǎo)者M(jìn)atthias Mann教授團(tuán)隊(duì)在頂刊Nature上發(fā)表了題為“Spatial proteomics identifies JAKi as treatment for a lethal skin disease”的重大研究成果。該項(xiàng)研究的發(fā)布再次展示了蛋白質(zhì)組學(xué)從機(jī)制研究到臨床治療方法開(kāi)發(fā)的全流程。學(xué)習(xí)思路方法,文章和轉(zhuǎn)化成果雙贏。
中毒性表皮壞死松解癥（TEN）是一種由常見(jiàn)藥物引發(fā)的致命皮膚反應(yīng)，患者會(huì)因角質(zhì)形成細(xì)胞死亡而出現(xiàn)嚴(yán)重的表皮脫離，其主要驅(qū)動(dòng)因素仍未知，并且沒(méi)有針對(duì)TEN的有效治療方法。在本研究中作者采用:
1、空間蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)：深度視覺(jué)蛋白質(zhì)組學(xué)（DVP）技術(shù)，通過(guò)單細(xì)胞分辨率的蛋白質(zhì)組學(xué)分析了三種嚴(yán)重程度不同的FFPE患者皮膚樣品。對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚浸潤(rùn)免疫細(xì)胞中的 5,000 多種蛋白質(zhì)進(jìn)行了定量分析，揭示了 JAK/STAT 和干擾素信號(hào)通路是 TEN 的關(guān)鍵致病驅(qū)動(dòng)因素。
2、體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：體外使用 pan-JAK 抑制劑托法替尼進(jìn)行靶向抑制降低了角質(zhì)形成細(xì)胞定向的細(xì)胞毒性。托法替尼、巴瑞克替尼或 JAK1 特異性抑制劑阿布昔替尼或?yàn)跖撂婺岬捏w內(nèi)口服給藥改善了兩種不同的 TEN 小鼠模型的臨床和組織學(xué)疾病嚴(yán)重程度。
3、人體實(shí)驗(yàn)：7 例 TEN 患者經(jīng)JAK 抑制劑（JAKi）治療后展現(xiàn)出快速皮膚再上皮化和恢復(fù)。
深度視覺(jué)蛋白質(zhì)組學(xué)（DVP）技術(shù)是對(duì)福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣品進(jìn)行單細(xì)胞分辨率的空間蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析。采用該技術(shù)對(duì)輕度（自發(fā)性斑丘疹MPR）和重度（TEN或全身癥狀的藥物反應(yīng)DRESS）的皮膚藥物不良反應(yīng) （CADR）患者以及健康個(gè)體的FFPE 皮膚樣本進(jìn)行了分析（如圖1，對(duì) CD45 免疫細(xì)胞和泛細(xì)胞角蛋白（Pan-CK）角質(zhì)形成細(xì)胞的 FFPE 組織切片進(jìn)行了染色，然后進(jìn)行了細(xì)胞分割）。
圖 1：皮膚藥物反應(yīng)中角質(zhì)形成細(xì)胞的 DVP 工作流程和細(xì)胞類型特異性蛋白質(zhì)組。
a，上圖為CADR 中細(xì)胞類型分辨蛋白質(zhì)組學(xué)的 DVP 工作流程示意圖（n = 21; DRESS、MPR 和健康各 5 個(gè)，TEN 共6 個(gè)）；下圖是每個(gè)步驟的代表性圖像，包括從FFPE切片切割的角質(zhì)形成細(xì)胞（黃色圈選）和免疫細(xì)胞（紅色圈選）。b，跨隊(duì)列角質(zhì)形成細(xì)胞中鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)量。c-e，主成分分析，主要驅(qū)動(dòng)因素和PC1的基因集富集分析。f，TEN和健康角質(zhì)形成細(xì)胞中的差異表達(dá)蛋白。g，顯著差異蛋白聚類。h，Cluster1 的Reactome富集分析。i，補(bǔ)體因子熱圖。
為了確定疾病和細(xì)胞類型特異性的分子機(jī)制，首先分析了來(lái)自 CADR 的病變角質(zhì)形成細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。角質(zhì)形成細(xì)胞蛋白質(zhì)組根據(jù)藥物反應(yīng)的類型聚集，主成分1（PC1）將 TEN 與其他 CADR 和健康個(gè)體分開(kāi)（圖1c）。PC1 與參與鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的蛋白 （HSPA5、TMCO1 和 ATP2A2）強(qiáng)相關(guān)，GSEA富集分析顯示STAT3 是PC1區(qū)分能力的主要驅(qū)動(dòng)因素（圖1d-e）。與來(lái)自健康個(gè)體的細(xì)胞相比，差異表達(dá)蛋白（DEP） 的數(shù)量隨著 CADR 的嚴(yán)重程度而增加，DRESS 角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合物 I 類蛋白 TAP1、TAP2、TAPBP 和 HLA-A 的量是健康的兩倍以上，表明角質(zhì)形成細(xì)胞積極參與藥物相關(guān)抗原呈遞。
皮膚免疫細(xì)胞浸潤(rùn)模式在 CADR 之間存在顯著差異。蛋白質(zhì)組學(xué)分析展現(xiàn)了免疫細(xì)胞中潛在的分子差異。按疾病表型聚集，但與角質(zhì)形成細(xì)胞相比，PC1 將 DRESS 與其他 CADR 區(qū)分開(kāi)來(lái)（圖 2）。DRESS中多個(gè)病毒通路富集，而TEN 具有干擾素特征，其中 STAT1 是主要驅(qū)動(dòng)因素（圖2b-d）。GZMB是細(xì)胞毒性的關(guān)鍵介質(zhì)，在TEN以及非細(xì)胞毒性 DRESS 中均高表達(dá)（圖2f）。
圖 2：病變免疫細(xì)胞的細(xì)胞類型特異性蛋白質(zhì)組
a，主成分分析，n=5。b，PC1 和 PC3基因集富集評(píng)分的散點(diǎn)圖。c–e，健康細(xì)胞與 MPR （c）、TEN （d） 或 DRESS（e）免疫細(xì)胞之間的 DEP。f，差異蛋白在不同疾病狀態(tài)的豐度。g，顯著差異蛋白聚類。h，Cluster1 的Reactome富集分析。
對(duì)四個(gè)疾病狀態(tài)免疫細(xì)胞DEPs 的聚類得到3個(gè)Cluster（圖2g）。主要代表 DRESS 的Cluster 2富含 DNA 復(fù)制過(guò)程，說(shuō)明DRESS中浸潤(rùn)免疫細(xì)胞是增殖性質(zhì)的。Cluster 1 包含主要與 I 和 II 型干擾素信號(hào)相關(guān)的蛋白（圖2h），在TEN中顯著上調(diào)，再次證明了TEN 具有干擾素特征。
前面的數(shù)據(jù)表明干擾素通路在 TEN 中上調(diào)，研究者接著利用多重?cái)?shù)據(jù)非依賴型采集 （mDIA） 工作流程分析了TEN 和 SJS-TEN患者皮膚樣品中CD163+ 巨噬細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞和 CD8+ T 細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)（圖3a）。從每種免疫細(xì)胞類型的 20 個(gè)細(xì)胞中，檢測(cè)出中位數(shù)2,104 個(gè)，總共 5,302 個(gè)蛋白（圖3b）。巨噬細(xì)胞中干擾素相關(guān)的蛋白表達(dá)最高，干擾素介質(zhì)STAT1顯著高于其他兩種細(xì)胞類型（圖3d-e）。
圖 3：TEN 中免疫細(xì)胞亞型的空間蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
a，左圖為CD163+巨噬細(xì)胞、CD4+ 和 CD8+ T 細(xì)胞的 TEN 皮膚組織免疫熒光圖；右圖為切割輪廓。b-c，所有樣品中鑒定出的蛋白質(zhì)數(shù)量和強(qiáng)度。d，干擾素通路蛋白熱圖。e，免疫細(xì)胞亞型的 STAT1 表達(dá)。f，巨噬細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞之間的 DEP。g，TEN 樣品的免疫熒光。h，在角質(zhì)形成細(xì)胞中鑒定的蛋白數(shù)和強(qiáng)度分布。i，顯著差異蛋白聚類。j-k，主成分分析及其驅(qū)動(dòng)因素。l-m，在分離細(xì)胞與貼壁細(xì)胞之間變化的目標(biāo)蛋白。
研究者進(jìn)一步分析了來(lái)自同一活檢中分離（Detached，水皰頂）和附著（Attached，水皰側(cè)）的角質(zhì)形成細(xì)胞之間的空間差異，每種類型和患者僅 20 個(gè)細(xì)胞（圖3g）。在三個(gè)Cluster中，最大Cluster的包括補(bǔ)體系統(tǒng)和炎癥（圖3i）。這些蛋白甚至在TEN附著的角質(zhì)形成細(xì)胞中上調(diào)，表明驅(qū)動(dòng)TEN的炎癥途徑已經(jīng)在水皰皮膚附近的角質(zhì)形成細(xì)胞中被激活（圖3j-m）。
嚴(yán)重炎癥性疾病的特征是細(xì)胞串?dāng)_和反饋回路改變從而加劇免疫反應(yīng)，細(xì)胞類型解析揭示了這種疾病特異性反饋回路。作者假設(shè)，在角質(zhì)形成細(xì)胞和免疫細(xì)胞中都受到強(qiáng)烈調(diào)節(jié)的蛋白能鑒別出與治療相關(guān)的通路。與健康對(duì)照相比，TEN 的角質(zhì)形成細(xì)胞和免疫細(xì)胞中的六種蛋白（WARS1、STAT1、S100A9、LYZ、GBP1 和 APOL2）上調(diào)至少四倍（圖4a），這六種蛋白都位于干擾素通路中，而干擾素通過(guò)JAK / STAT 通路發(fā)出信號(hào)，因此作者分析了JAK / STAT 通路。STAT1 和 STAT3 在免疫細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中均上調(diào)，而 STAT2 僅在角質(zhì)形成細(xì)胞中上調(diào)，STAT5 在免疫細(xì)胞中上調(diào)。大多數(shù)干擾素刺激基因 （ISG） 產(chǎn)物要么有效上調(diào)，如 GBP1 增加 9 倍，要么僅在 TEN 中可檢測(cè)到，例如 GBP5（圖4b）。
圖 4：JAK/STAT 通路在 TEN 中被有效激活。
a，與健康參與者相比，TEN 患者角質(zhì)形成細(xì)胞 （CK） 和免疫 （CD45） 細(xì)胞中的 DEP。b， 免疫細(xì)胞（左半圓）和角質(zhì)形成細(xì)胞（右半圓）中的 JAK/STAT 通路蛋白。c-d，與健康組織相比，TEN 中所選細(xì)胞因子（c）和 JAK/STAT 通路組分（d）的差異表達(dá) mRNA 轉(zhuǎn)錄本。e-f，跨隊(duì)列組織切片中 STAT1 和泛細(xì)胞角蛋白（e）和磷酸化STAT1（pSTAT1）。g-h，TEN 的磷酸化蛋白組，STATs的磷酸化位點(diǎn)。
細(xì)胞因子激活 JAK/STAT 通路，為了研究其激活，作者在更大的 CADR 患者隊(duì)列中使用了靶向轉(zhuǎn)錄組學(xué)。在通過(guò)JAK/STAT發(fā)出信號(hào)的細(xì)胞因子的編碼基因中，IFNG表達(dá)在 TEN 中上調(diào)最高。STAT1 的上調(diào)表明嚴(yán)重 CADR 具有共同的炎癥途徑。作者用IF/IHC驗(yàn)證了TEN 患者的皮膚浸潤(rùn)免疫細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞STAT1 定位和磷酸化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn) TEN中STAT1定位到核內(nèi)并激活（圖 4e-f）。作者還做了磷酸化蛋白組，發(fā)現(xiàn)STAT1有4個(gè)位點(diǎn)被磷酸化（圖4g-h）。總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明 JAK/STAT 通路的激活是 TEN 的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。
為了探究這些發(fā)現(xiàn)的臨床意義，研究者開(kāi)發(fā)了一種新的體外模型來(lái)真實(shí)地復(fù)制皮膚藥物反應(yīng)。在這種自體共培養(yǎng)模型中，活化的PBMC在 72 小時(shí)內(nèi)殺死角質(zhì)形成細(xì)胞，且可以被 pan-JAK 抑制劑Tofacitinib以劑量依賴性方式抑制（圖5a-c）。
圖 5：JAK/STAT 抑制可降低體外和體內(nèi) TEN 的嚴(yán)重程度
a-b，活細(xì)胞成像分析。c，口服藥物方案。d-j、臨床評(píng)估（d、g、h）、組織學(xué)（e）、真皮厚度（f ;每只小鼠 15 次測(cè)量）、病變大?。╥）和體重變化（j）在治療前（d-g）和治療模型（h-j）。k，TEN 人源化小鼠模型中口服 JAKi 治療的示意圖。I-n分別是藥物治療前后的眼反應(yīng)，疾病發(fā)生率和上皮下細(xì)胞死亡百分比的比較圖表。
研究者接下來(lái)進(jìn)一步評(píng)估了口服 JAKi 在已建立的 TEN 小鼠模型中的療效。用 pan-JAK 抑制劑Tofacitinib或 JAK1 和 JAK2 抑制劑Baricitinib口服治療在治療的第 1 天和第 3 天成功降低了肉眼可見(jiàn)的疾病嚴(yán)重程度（圖 5d）。可檢測(cè)到皮膚磷酸化 STAT1 增加的信號(hào)在 JAKi 處理后顯著降低（圖5e）。平均真皮厚度恢復(fù)到正常水平（圖5f）。JAKi 減少了角質(zhì)形成細(xì)胞的死亡，并且減少了免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。JAKi 處理的小鼠的表皮恢復(fù)加速（圖5 g-i）。
研究者進(jìn)一步在已建立的 TEN 人源化小鼠模型中測(cè)試了Baricitinib的療效，該模型將 TEN 患者的 PBMC 靜脈注射到免疫缺陷小鼠中（圖 5k），發(fā)生嚴(yán)重的眼結(jié)膜炎和結(jié)膜上皮細(xì)胞死亡。Baricitinib治療顯著減少了眼結(jié)膜炎和結(jié)膜上皮細(xì)胞死亡（圖 5 l-n）?？傊?，體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)證明了 JAKi 在 TEN 臨床前模型中的療效。
根據(jù)前期良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究者們開(kāi)展了 7 名 TEN 或 SJS-TEN 重疊的患者治療探索。其中一位 59 歲的小細(xì)胞肺癌男性正在接受卡鉑、依托泊苷和 PD1 拮抗劑斯魯利單抗治療（圖6）。在第三個(gè)周期的癌癥治療后發(fā)展為 TEN，表皮脫離影響了 35% 的體表，疾病嚴(yán)重程度評(píng)分（SCORTEN） 為 4，表明預(yù)測(cè)死亡率為 58.3%。盡管靜脈注射大劑量激素，但表皮脫離仍在進(jìn)展。使用Abrocitinib進(jìn)行 JAK1 抑制劑挽救治療，在2天內(nèi)TEN停止進(jìn)展，4天內(nèi)可見(jiàn)再上皮化，16 天后達(dá)到接近完全（95%），患者在 TEN 完全康復(fù)后出院。這 7 名接受 JAKi 治療的患者在第30天都存活且無(wú)副作用。值得注意的是，在 JAKi 治療后，這 7 名患者的皮膚磷酸化 STAT1 水平均顯著降低。這些臨床數(shù)據(jù)顯示了 JAK1 或 pan-JAK 抑制治療 TEN 的潛力。
圖 6：JAK/STAT 抑制對(duì) TEN 患者的有益影響。
與癌癥治療相關(guān)的 TEN（SCORTEN 4）患者的病程。在大劑量靜脈注射甲潑尼龍治療期間觀察到TEN進(jìn)展，患者出現(xiàn)持續(xù)性高血糖。第4天開(kāi)始使用Abrocitinib挽救治療，在48小時(shí)內(nèi)停止進(jìn)展，在4天內(nèi)再上皮化。
研究者利用DVP技術(shù)，對(duì)藥物誘導(dǎo)的皮膚反應(yīng)患者的 FFPE 皮膚切片中角質(zhì)形成細(xì)胞和免疫細(xì)胞的空間蛋白質(zhì)組進(jìn)行了分析，對(duì)每種細(xì)胞類型多達(dá) 5,000 種蛋白質(zhì)進(jìn)行了定量分析。對(duì)治療干預(yù)CADR 的分子機(jī)制提供了重要見(jiàn)解。
研究發(fā)現(xiàn)TEN 中 JAK/STAT 通路的顯著上調(diào)，該信號(hào)通路被研究中一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)是皮膚炎癥、角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞毒性和表皮脫離的主要驅(qū)動(dòng)因素。然后全面研究了 JAKi 在一種新型細(xì)胞培養(yǎng)模型中的體外效果和在兩種獨(dú)立小鼠模型中的體內(nèi)效果，所有這些模型都顯示出一致的治療益處。最后臨床治療了 7 例 TEN 或 SJS-TEN 重疊綜合征患者，所有患者對(duì) JAKi 反應(yīng)良好，治療后完全康復(fù)出院。這些數(shù)據(jù)為 TEN 早期 JAKi 療法的臨床試驗(yàn)鋪平了道路，有可能改變這種致命不良反應(yīng)對(duì)常見(jiàn)藥物的結(jié)果。
亮點(diǎn)：該研究是將新興的細(xì)胞類型分辨空間組學(xué)技術(shù)，與一種對(duì)患者有益的新治療方式直接聯(lián)系起來(lái)的成功案例。類似的方法可以通過(guò)幫助確定關(guān)鍵的可成藥靶點(diǎn)并更精確地選擇治療方法，在廣泛的炎癥或腫瘤疾病中產(chǎn)生變革性的轉(zhuǎn)化研究意義。
青蓮百奧空間蛋白質(zhì)組學(xué)項(xiàng)目在國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)界引起了廣泛關(guān)注。2022年7月，青蓮百奧與中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院合作，在《Nature Communications》上共同發(fā)表了國(guó)內(nèi)首篇關(guān)于空間蛋白質(zhì)組學(xué)的研究論文“Spatially resolved proteomic map shows that extracellular matrix regulates epidermal growth”，為國(guó)內(nèi)空間蛋白質(zhì)組學(xué)的研究樹(shù)立了新的標(biāo)桿。
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