單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)是人們研究的熱點(diǎn)，目前已可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞4000-5000種蛋白質(zhì)檢測（>>>點(diǎn)擊直達(dá)：4000+ | 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組，你也需要升級迭代！）。隨著技術(shù)的快速發(fā)展，超微量的前處理技術(shù)和超高靈敏度的質(zhì)譜技術(shù)推動了研究者們從單細(xì)胞中挖掘更多的信息。

2024年7月19日，美國明尼蘇達(dá)州梅奧診所實(shí)驗(yàn)室的研究者們在Communications biology上發(fā)表論文[1]，探討了蛋白翻譯后修飾、突變肽等的單細(xì)胞異質(zhì)性問題。

梅奧診所的研究團(tuán)隊(duì)在前期實(shí)驗(yàn)中通過優(yōu)化捕獲離子遷移譜 (TIMS) 的設(shè)置，證明了在無標(biāo)記模式下以單細(xì)胞分辨率檢測磷酸化和乙?；目尚行訹2]。該研究團(tuán)隊(duì)使用timsTOF SCP質(zhì)譜儀對人類正常膽管細(xì)胞系和膽管癌細(xì)胞系進(jìn)行了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組和 PTM 分析，包括磷酸化、甲基化和乙?；?，除此之外還首次進(jìn)行了癌細(xì)胞常見突變蛋白的突變肽分析，以及單細(xì)胞核蛋白質(zhì)組學(xué)的嘗試。

單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)

圖1. 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程

根據(jù)工作流程（圖1），作者采用了數(shù)據(jù)非依賴采集 (DIA) 并行積累-連續(xù)碎片 （diaPASEF） 模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測。相比大細(xì)胞量蛋白質(zhì)組學(xué)DDA數(shù)據(jù)建庫的結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)2~5ng蛋白量（大約20~50個(gè)細(xì)胞）DDA檢測建庫能實(shí)現(xiàn)最大蛋白質(zhì)組覆蓋率，且與不建庫模式相比，建庫后基于庫的蛋白鑒定數(shù)量明顯更多（圖2）。

圖2. diaPASEF建庫蛋白輸入量探索（使用DIA-NN搜庫）

作者對正常人膽管細(xì)胞系 (NHC) 和三種膽管癌細(xì)胞系 (HuCCT-1、RBE 和 EGI-1) 進(jìn)行了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析。從 200 個(gè)單細(xì)胞中共鑒定出 4197 種蛋白質(zhì)（41,560種肽），平均每個(gè)細(xì)胞 2548 種蛋白質(zhì)（圖3）。降維聚類結(jié)果顯示正常細(xì)胞（NHC）和癌細(xì)胞分離，三種癌細(xì)胞有一定程度分離。差異表達(dá)分析顯示，與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞中 84 種蛋白質(zhì)上調(diào)，131 種蛋白質(zhì)下調(diào)。蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位顯示，大多數(shù)已鑒定的蛋白質(zhì)（56%）屬于細(xì)胞質(zhì)，其次是細(xì)胞核（27%）和質(zhì)膜（8%），鑒定的蛋白質(zhì)中，酶占大多數(shù)（961 種蛋白質(zhì)），還伴有 262 種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、227 種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、145 種激酶和 64 種磷酸酶。

圖3.單細(xì)胞蛋白組基本分析（PCA降維聚類、差異分析、蛋白亞細(xì)胞定位、蛋白功能注釋）

單細(xì)胞PTM分析

除了單細(xì)胞蛋白表達(dá)分析，作者還對數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白翻譯后修飾分析。共鑒定出 192 種磷酸化肽（116 種蛋白質(zhì)的 182 個(gè)位點(diǎn)）、24 種賴氨酸甲基化肽（19 種蛋白質(zhì)的 24 個(gè)位點(diǎn)）、20 種賴氨酸二甲基化肽（13 種蛋白質(zhì)的 17 個(gè)位點(diǎn)）、14 種賴氨酸三甲基化肽（10 種蛋白質(zhì)的 11 個(gè)位點(diǎn)）、17 種賴氨酸乙?；模?3 種蛋白質(zhì)的 14 個(gè)位點(diǎn)）和 16 種賴氨酸甲?；模?2 種蛋白質(zhì)的 16 個(gè)位點(diǎn)）（圖4）。不富集直接搜庫的結(jié)果顯示本方法可以檢測到蛋白的多個(gè)修飾位點(diǎn)，例如鑒定出核仁素的四個(gè)磷酸化位點(diǎn)（Ser 67、Thr 76、Thr 121 和 Ser 563），這些鑒定結(jié)果通過合成肽的洗脫時(shí)間和碎片離子得到證實(shí)（圖4a）。還檢測到了組蛋白和延伸因子 1-alpha 1 等蛋白的多種 PTM，例如在組蛋白 3.1 的賴氨酸（K14、K23、K27 和 K79）上檢測到了甲基化、二甲基化、三甲基化、乙酰化和甲?；任宸N類型的 PTM（圖4b）。組蛋白 H3 修飾會影響基因表達(dá)，例如 H3K14 乙?；c基因表達(dá)激活相關(guān)，已知后者與 H3K23 乙?；泊娌⑴悸?lián)；H3K79 甲基化與活性基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)相關(guān)；而 H3K27 甲基化通過接近或環(huán)化沉默基因表達(dá)相關(guān)，并且 H3K79 甲酰化被認(rèn)為可能沉默基因表達(dá)。因此，作者利用單細(xì)胞水平的組蛋白 H3 修飾數(shù)據(jù)，計(jì)算了激活基因表達(dá)與抑制基因表達(dá)的 PTM 比率以觀察細(xì)胞整體的轉(zhuǎn)錄活性（圖4c）。從結(jié)果能觀察到較高的比率可能表明大多數(shù)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性較高，這證實(shí)了所研究的細(xì)胞是增殖性腫瘤細(xì)胞系。以上的結(jié)果顯示：以單細(xì)胞水平的組蛋白修飾作為介質(zhì)，有可能在單細(xì)胞分辨率下揭示由基因調(diào)控和轉(zhuǎn)錄活性驅(qū)動的單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)。

圖4. 單細(xì)胞數(shù)據(jù)中鑒定出的蛋白質(zhì)、磷酸化、N 端乙?；①嚢彼釂渭谆?、二甲基化、三甲基化、乙?；图柞；牡臄?shù)量

單細(xì)胞突變肽分析：單一氨基酸多態(tài)性SAP

作者通過整合上述三種癌細(xì)胞系體細(xì)胞單核苷酸變異 (SNP) 數(shù)據(jù)庫 (depmap.org)，檢驗(yàn)了在單細(xì)胞水平上檢測具有單一氨基酸多態(tài)性 (SAP) 肽的可行性。通過分析合成肽混合物并評估洗脫時(shí)間和碎裂模式的相似性來鑒別這些肽（圖1）。作者在單細(xì)胞水平上成功地鑒定了含有與 G12D 相對應(yīng)的 KRAS 變異的肽以及其他三種變異——IQGAP1 G1047R、CCT8 A488T 和 GMPS R435T（圖5a）。重要的是，具有 KRAS G12D 變異的肽 LVVVGADGVGK 僅在 HuCCT-1 和 EGI-1 細(xì)胞中檢測到，而未在 RBE 細(xì)胞中檢測到，這與 DepMap 中注釋的基因組測序結(jié)果一致。同樣，源自 CCT8 A4888T 變異的肽 NVGLDIEAEVPTVK 僅在 RBE 細(xì)胞中檢測到，這再次與 DepMap 中的數(shù)據(jù)一致。隨著單細(xì)胞蛋白質(zhì)組覆蓋深度的不斷發(fā)展，更多來自其他類型變異（如插入/缺失和融合基因）的肽可能會被檢測到。

圖5. 以單細(xì)胞分辨率識別 SAP

單個(gè)細(xì)胞核的蛋白質(zhì)組學(xué)與PTM分析

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)展出了單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組學(xué)，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)能不能也發(fā)展出單細(xì)胞核蛋白質(zhì)組呢？作者嘗試按照snRNA-seq的方法制備了用他澤司他處理的漿液性卵巢癌細(xì)胞系 PEO1的單細(xì)胞核懸液，他澤司他是一種臨床批準(zhǔn)的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 EZH2 的表觀遺傳抑制劑，可甲基化組蛋白 3.1 的賴氨酸 27（圖6a）。按照上述的方案，生成了30個(gè)單核樣本的 diaPASEF 數(shù)據(jù)，處理組和對照組分別有15個(gè)細(xì)胞核，共計(jì)得到 6221 個(gè)肽，對應(yīng) 1008 種蛋白質(zhì)，平均每個(gè)樣本 627 種蛋白質(zhì)（圖6c）。重點(diǎn)是作者在 K14、K23、K27 和 K79 鑒定出組蛋白 H3.1 的六種不同 PTM，其中大多數(shù)在每個(gè)單核樣本中都能檢測到（圖6d）。他澤司他治療后，H3K27 的三甲基化水平降低，而組蛋白 H3.1 的總蛋白質(zhì)豐度沒有顯著變化（圖6e）。上述結(jié)果證明：單核蛋白質(zhì)組學(xué)不僅可行還可以通過檢測組蛋白修飾來研究可能影響基因表達(dá)的藥物的具體機(jī)制。

圖6. 單核蛋白質(zhì)組和 PTM 分析

總結(jié)

本研究進(jìn)行了單細(xì)胞/單細(xì)胞核蛋白質(zhì)組學(xué)、單細(xì)胞/單細(xì)胞核蛋白翻譯后修飾組學(xué)以及單細(xì)胞SAP分析研究，證明了單個(gè)細(xì)胞甚至單個(gè)細(xì)胞核的超低微量蛋白質(zhì)能夠應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)和蛋白翻譯后修飾研究，使得單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究向前又邁了一步。

青蓮百奧擁有成熟的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)平臺，專業(yè)的生信團(tuán)隊(duì)，負(fù)責(zé)的售后技術(shù)，提供一站式的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究解決方案，助力相關(guān)領(lǐng)域研究。青蓮百奧在Hela細(xì)胞的單細(xì)胞蛋白鑒定測試中取得了突破性成果，單個(gè)細(xì)胞的蛋白檢測深度達(dá)到了4000以上，更深入地揭示細(xì)胞間的蛋白表達(dá)差異。

參考文獻(xiàn)

[1] Mun, DG., Bhat, F.A., Joshi, N. et al. Diversity of post-translational modifications and cell signaling revealed by single cell and single organelle mass spectrometry. Commun Biol 7, 884 (2024).

[2]Mun, D. G. et al. Optimizing single cell proteomics using trapped ion mobility spectrometry for label-free experiments. Analyst 148, 3466–3475 (2023).