?先是質(zhì)譜原理的原因，因?yàn)閿?shù)據(jù)采集是DDA的模式即數(shù)據(jù)依賴性采集：是豐度排名在前20的肽段進(jìn)行?級(jí)碎裂，所以鑒定到的肽段均是豐度?較高的。
豐度?蛋?酶解后的多肽，在每個(gè)保留時(shí)間都有分布，因此?部分時(shí)間點(diǎn)，都被?豐度蛋?的?豐度肽段占據(jù)，質(zhì)譜花費(fèi)?量時(shí)間在采集?豐度蛋?的肽段信息，?沒有機(jī)會(huì)采集低豐度蛋?信息，因此導(dǎo)致鑒定的蛋?數(shù)量偏少。
?豐度蛋?會(huì)有影響鑒定數(shù)量，?豐度的蛋?會(huì)不斷被采集，而低豐度蛋?被檢測的機(jī)會(huì)降低，因此需要在前處理時(shí)將高豐度蛋白盡量多的去除掉。
①Bradford法。其原理為，蛋白質(zhì)與染料考?斯亮藍(lán)G-250結(jié)合，使得染料最?吸收峰從465nm變?yōu)?95nm，在?定的線性范圍內(nèi)，反應(yīng)液595nm處吸光度的變化量與反應(yīng)蛋?量成正比，測定595nm處吸光度的增加即可進(jìn)?蛋?定量。能耐受較高的還原劑，例如DTT可達(dá)5mM，但是不能耐受去垢劑如SDS要低于0.1%，去垢劑會(huì)嚴(yán)重影響定量結(jié)果。
②BCA法。其原理為，在堿性環(huán)境下，蛋?與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1+（biuret reaction）。BCA與Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的藍(lán)紫?復(fù)合物，在562nM處有?的光吸收值并與蛋?質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測定蛋?質(zhì)濃度。能耐受較高的去垢劑，比如SDS能達(dá)到4%，但是不能耐受還原劑，DTT必須在0.2mM以下。
因此如何選擇定量?法主要依據(jù)蛋白溶液成分，通過稀釋樣本等?式使溶液成分都在定量?法的耐受范圍內(nèi)。
8M urea 50m M tris-HCl，蛋?酶抑制劑。
堅(jiān)硬組織（樹?、?發(fā)、老化皮膚、骨組織、指甲、昆蟲殼組織、貝殼、鈣化組織）；含?豐度蛋?的體液（血液、尿液、唾液、腦脊髓液、卵泡液、細(xì)胞或菌類培養(yǎng)基上清）；含?豐度蛋?的組織或細(xì)胞（卵細(xì)胞、肌肉組織、肌細(xì)胞相關(guān)組織、種?）；蛋?較少的組織或細(xì)胞（動(dòng)物精?細(xì)胞、老化葉?、植物莖、果肉）；微?物、藻類（細(xì)菌真菌通常覆蓋度60%或以上）。
簡單樣本：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)蛋白，?少3次?物學(xué)重復(fù)。
復(fù)雜樣本：考慮到個(gè)體差異及后期組間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，簡單樣本如植物、動(dòng)物模型每組5個(gè)以上?物學(xué)重復(fù)，最少保證3個(gè)。復(fù)雜樣本如（?的?液或組織樣本），由于個(gè)體特異性高，建議每組30個(gè)以上樣 本，最少保證10個(gè)生物學(xué)重復(fù)。如果臨床樣本實(shí)驗(yàn)?的為biomaker尋找，且經(jīng)費(fèi)有限，推薦進(jìn)?混樣。
統(tǒng)計(jì)學(xué)要求兩組?較的話，至少三重復(fù)才能計(jì)算出P Value，才能知曉是否具有顯著差異性；為了提升數(shù)據(jù)質(zhì)量、結(jié)果產(chǎn)出及順利投稿，必須注意?物學(xué)重復(fù)問題。
@2024北京青蓮百奧生物科技有限公司 京ICP備17052224號(hào)
