藥物在不同患者中療效差異顯著，這不僅與基因變異有關(guān)，還源于蛋白質(zhì)層面的微小變化?；蚩赏ㄟ^剪接和翻譯后修飾生成多種蛋白質(zhì)異構(gòu)體（Proteoforms），這些異構(gòu)體直接影響藥物靶向和療效。然而，傳統(tǒng)研究多聚焦單一蛋白質(zhì)，忽視了異構(gòu)體的關(guān)鍵作用，尤其在無基因突變時(shí)，其重要性更為凸顯。要全面理解藥物機(jī)制及副作用，亟需精準(zhǔn)工具揭示蛋白質(zhì)異構(gòu)體的復(fù)雜性，為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)開辟新路徑。

2025年2月25日，熱蛋白質(zhì)組學(xué)開發(fā)者團(tuán)隊(duì)成員，瑞典卡羅林斯卡學(xué)院Rozbeh Jafari團(tuán)隊(duì)在期刊Nat Commun（IF=14.7）上發(fā)表了題為“Functional proteoform group deconvolution reveals a broader spectrum of ibrutinib off-targets”的研究論文，該研究利用熱蛋白質(zhì)組學(xué)（TPP）探究伊布替尼治療白血?。–LL）的靶點(diǎn)及脫靶點(diǎn)，并通過蛋白異構(gòu)體研究揭示了伊布替尼對(duì)特定蛋白變體的特異性結(jié)合及其生物學(xué)效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)不僅擴(kuò)展了對(duì)伊布替尼作用機(jī)制的理解，還為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和藥物開發(fā)提供了重要的理論依據(jù)和技術(shù)支持[1]。

樣本信息

• 細(xì)胞系樣本：RCH-ACV（前體B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系）和SW13（腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞系）的裂解液用于TPP實(shí)驗(yàn)，設(shè)置Ibrutinib處理組和DMSO對(duì)照組。

• CLL樣本：68例CLL患者的外周血臨床樣本用于質(zhì)譜分析，以評(píng)估功能蛋白質(zhì)形式分組在臨床治療中的變化，設(shè)置Ibrutinib治療組和未治療組。

研究亮點(diǎn)

• 功能性蛋白異構(gòu)體組分析：通過TPP系統(tǒng)分析ibrutinib的靶點(diǎn)和脫靶點(diǎn)，揭示其廣泛作用機(jī)制。

• 蛋白異構(gòu)體藥物敏感性差異發(fā)現(xiàn)：ibrutinib對(duì)BRAF、YES1的特定異構(gòu)體組具有特異性結(jié)合，揭示更細(xì)致的藥物機(jī)制。

• 臨床樣本驗(yàn)證：在CLL患者中，蛋白異構(gòu)體組豐度變化（如WASHC2C_1）與治療反應(yīng)相關(guān)，解釋敏感性與耐藥性。

• 高剪接亞組獨(dú)特發(fā)現(xiàn)：在ASB-CLL亞組中，識(shí)別與ibrutinib敏感性相關(guān)的異構(gòu)體組（如BZW2_2），為治療策略提供新思路。

研究結(jié)果

一、功能性蛋白變構(gòu)體組的識(shí)別

通過熱蛋白質(zhì)組分析（TPP），研究團(tuán)隊(duì)在ibrutinib處理的細(xì)胞裂解物中成功識(shí)別了16079個(gè)功能性蛋白異構(gòu)體組。這些蛋白異構(gòu)體組在熱穩(wěn)定性上表現(xiàn)出顯著差異，尤其是在ibrutinib處理與未處理的條件下。研究不僅驗(yàn)證了ibrutinib的已知靶點(diǎn)，如BTK（Bruton酪氨酸激酶），還發(fā)現(xiàn)了新的潛在靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)涉及高爾基體運(yùn)輸、糖基化、細(xì)胞粘附和內(nèi)體處理等功能。這些新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提示，ibrutinib可能通過這些蛋白異構(gòu)體組在免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞過程調(diào)控中發(fā)揮更廣泛的作用。

二、伊布替尼對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)合物和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的影響

ibrutinib的結(jié)合可能引發(fā)蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化或變構(gòu)效應(yīng)，進(jìn)而改變靶點(diǎn)與其結(jié)合伙伴之間的相互作用。通過過度表達(dá)分析（ORA），研究團(tuán)隊(duì)識(shí)別了多個(gè)受ibrutinib影響的蛋白質(zhì)復(fù)合物，包括CORVET、HOPS和NUMAC復(fù)合物。這些復(fù)合物在細(xì)胞中參與多種關(guān)鍵過程，如膜運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)和染色質(zhì)重塑，表明ibrutinib可能通過調(diào)控這些復(fù)合物的功能來發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。

三、功能性蛋白組分析能夠更細(xì)致地識(shí)別藥物靶點(diǎn)

通過分析BRAF和YES1的功能性蛋白異構(gòu)體組，研究發(fā)現(xiàn)ibrutinib對(duì)某些異構(gòu)體組具有特異性結(jié)合。BRAF的兩個(gè)異構(gòu)體組（BRAF_1和BRAF_2）在ibrutinib處理下熱穩(wěn)定性不同，提示其可能以不同構(gòu)象存在。YES1的兩個(gè)異構(gòu)體組（YES1_1和YES1_2）也表現(xiàn)出不同熱穩(wěn)定性，表明其N端調(diào)控區(qū)域（SNRE）可能影響ibrutinib結(jié)合。這些結(jié)果表明，蛋白異構(gòu)體組分析能更細(xì)致地揭示藥物結(jié)合特性，而基因水平分析可能掩蓋這些差異。

四、pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ibrutinib靶點(diǎn)

通過pull-down實(shí)驗(yàn)，研究團(tuán)隊(duì)驗(yàn)證了TPP識(shí)別的部分ibrutinib靶點(diǎn)，包括WASH復(fù)合物的WASHC2C_1、BTK的兩個(gè)功能性蛋白異構(gòu)體組（BTK_1和BTK_2）、src激酶家族成員FYN_1以及RAF激酶家族成員BRAF_1。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了功能性蛋白異構(gòu)體組分析的可靠性，并支持ibrutinib通過影響特定蛋白異構(gòu)體組來發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的假設(shè)。

五、CLL患者中功能性蛋白變構(gòu)體組的豐度變化與治療狀態(tài)相關(guān)

在慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）患者隊(duì)列中，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)功能性蛋白異構(gòu)體組的豐度變化與ibrutinib治療狀態(tài)密切相關(guān)。例如，WASHC2C_1在ibrutinib治療的患者中豐度顯著降低，而WASHC2C_2則無明顯變化。這些變化可能揭示了治療敏感性和耐藥性的潛在機(jī)制，并提示ibrutinib可能通過調(diào)控特定蛋白異構(gòu)體組的豐度來發(fā)揮其治療效果。

六、高剪接患者亞組中的蛋白變構(gòu)體組差異與ibrutinib反應(yīng)相關(guān)

在剪接體活性增強(qiáng)的CLL患者亞組（ASB-CLL）中，研究團(tuán)隊(duì)識(shí)別了一些與ibrutinib體外敏感性相關(guān)的功能性蛋白異構(gòu)體組。例如，BZW2_2的豐度與ibrutinib的體外敏感性顯著相關(guān)，提示該蛋白異構(gòu)體組可能在ibrutinib的耐藥性中起關(guān)鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)有助于解釋該亞組患者對(duì)ibrutinib的較差反應(yīng)，并為未來的治療策略提供新的思路。

研究結(jié)論

TPP作為高通量檢測(cè)蛋白異構(gòu)體藥物敏感性差異的蛋白質(zhì)組學(xué)工具，揭示了伊布替尼的更廣泛靶點(diǎn)譜，還解析了蛋白質(zhì)復(fù)合物和異構(gòu)體組的動(dòng)態(tài)變化。這些發(fā)現(xiàn)為理解藥物的作用機(jī)制、優(yōu)化治療方案以及推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供了重要的理論依據(jù)和技術(shù)支持。